一文读懂ChIPseq

一、介绍

• ChIP-seq，测序方法
  
  
  
  • 
    ChIP 指染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP），
  
  
  • 
    seq 指的是二代测序方法
  
  
  
  


• 作用：识别蛋白质与DNA互相作用情况


• 原理：染色质免疫共沉淀 + 二代测序


• 应用：常用于转录因子结合位点和组蛋白修饰位点的研究

二、测序原理

1、使用甲醛将目标蛋白与染色质交联固定起来

2、从细胞裂解液分离基因组DNA，通过超声打断DNA为一定长度的小片段

3、添加与目标蛋白质特异的抗体，该抗体与目标蛋白形成免疫沉淀免疫结合复合体

4、去交联，纯化DNA即得到染色质免疫沉淀的DNA样本，准备测序

5、建立好文库，用测序仪进行测序

详细测序过程可以参考：二代测序原理

三、检测蛋白质与DNA序列的结合峰

1、将测序得到的 DNA 片段（sequenced fragments）匹配到参考基因组

很显然，如果在基因组的某个位置蛋白质结合的概率越大，那么该位置检测到的 DNA 片段堆叠的就会越高。

2、使用空白对照（control）

为什么需要对照组？

• 一般检测出的峰值会有背景噪音，也就是会夹渣一些没有用抗体捕获的DNA片段也被测序了。


• 开放的染色质区域比封闭的区域更容易断裂


• 序列标签在基因组中分布不均


• 允许我们在比对的控件中与相同区域进行比较


• 消除 ENCODE 提供了 Black list的影响

所以会准备空白对照，排除假阳性，对照组有有两种：

• input DNA：不用任何抗体捕获的DNA；


• mock IP DNA：用不含有抗体的DNA

利用对照组去除实验组中的背景噪音，就会让我们检测到的峰更明显。

3、将覆盖到参考基因组的DNA片段堆叠用柱状图画出来，就会看到峰。

这里需要知道，ChIPseq是可以检测转录因子的结合，也可以检测组蛋白修饰的。而且二者有着截然不同的峰形：

转录因子结合的特征峰：

组蛋白修饰结合的特征峰：

当然我们也可以使用，UCSC基因组浏览器显示。

三、影响测序结果的因素

1、免疫共沉淀的影响

• 高效特异性抗体


• 起始物料量


• ChIP DNA产量取决于多种因素
  
  
  
  • 细胞类型
  
  
  • 标记或蛋白质丰富程度（组蛋白比TF具有更高的结合覆盖率）
  
  
  • 抗体质量
  
  
  
  

对于组蛋白，使用来自T细胞的20ug染色质DNA作为起始材料，总共会得到15-50ng DNA。

对于TF，通常从2500万个细胞（200ug染色质）中得到5-25ng。

-Subhash Tripathi，ResearchGate

• 染色质片段

  
  
  
  
  • 片段大小：影响ChIP-seq中的信噪比
  
  
  • 因细胞类型而异
  
  
  • 偏向启动子区域的片段会在ChIP AND对照（输入）样品中的启动子上引起ChIP-seq富集
  
  
  
  

2、测序的影响

• Reads 长度
  
  
  
  • 较长的 Reads 和双末端 Reads 可提高匹配率
  
  
  • 仅对于等位基因特异性染色质事件，转座因子研究而言是必需的
  
  
  
  


• 避免分批次


• 测序深度（最小5-10M；对于转录因子，标准为20-40M；对于组蛋白修饰宽谱图则更高）


• 序列输入对照的深度等于或大于IP样本

测序深度的影响

H3K4me3

H3K27me3

从每个子样本中H3K4me3，H3K36me3和H3K27me3回收的全部数据中获得的显著富集区域的百分比

对另外100万条 Reads 进行测序时，捕获的富集区域增加的百分比

https://academic.oup.com/nar/article/42/9/e74/1248114

3、重复样和重现性

• 重复多次通常比更高的深度更有效


• ***低深度测序高质量样本，而不是高深度低质量样本