编码速度非常慢_慢病毒包装基础原理amp;实验

最近需要用到慢病毒包装目的基因进行表达&＃xff0c;这篇笔记就是简单的记录了一下我的慢病毒相关知识的学习~

Background

慢病毒载体&＃xff08;lentivirus vector, LV&＃xff09;是一类来源于逆转录病毒的载体&＃xff0c;慢病毒之所以是称为慢病毒&＃xff0c;是因为感染的主要临床特点是在出现典型的临床症状以前&＃xff0c;经历较长的潜伏期&＃xff0c;之后缓慢发病。
1&＃xff1a;最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来&＃xff0c;而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用&＃xff0c;除了HIV病毒系统以外&＃xff0c;后续还有猿类免疫缺陷病毒&＃xff08;simian immunodeficiency virus, SIV&＃xff09;载体系统、猫免疫缺陷病毒&＃xff08;felines immunodeficiency virus, FIV&＃xff09;载体系统等。

2&＃xff1a;慢病毒的病毒结构病毒结构蛋白gag、pol和env。gag基因编码病毒的核心蛋白如核衣壳蛋白&＃xff08;p7&＃xff09;、内膜蛋白&＃xff08;p17&＃xff09;和衣壳蛋白&＃xff08;p24&＃xff09;&＃xff1b;pol基因编码病毒复制相关的酶&＃xff1b;env基因编码病毒包膜糖蛋白。病毒调节蛋白rev,tat。rev主要参与蛋白调节的表达水平&＃xff0c;tat参与蛋白转录的控制&＃xff0c;与病毒的长末端重复序列&＃xff08;long terminal repeats, LTRS&＃xff09;结合后促进病毒的所有基因的转录。四个辅助蛋白&＃xff0c;即vif、vpr、vpu、nef&＃xff0c;帮助病毒包装完成

How&＃xff1f;----慢病毒表达体系

讲了基本的原理&＃xff0c;那么慢病毒是如何包装的&＃xff1f;根据上面的知识点是只需要表达这些病毒结构的蛋白就对了嘛&＃xff1f;如何去实现呢&＃xff1f;把这些基因都整合到病毒的表达载体质粒上&＃xff0c;然后利用质粒表达各部分基因&＃xff0c;就可以组装成病毒了&＃xff01;

Q&＃xff1a;如何保证包出来的病毒不会有生化危险呢&＃xff1f;因为这些可是HIV的病毒体系呀
A&＃xff1a;将病毒体系拆分一下&＃xff0c;病毒表达体系有2质粒系统&＃xff0c;3质粒系统&＃xff0c;4质粒系统。
Q&＃xff1a;这些质粒系统有什么区别呢&＃xff1f;
A&＃xff1a;他们的安全系数不一样&＃xff0c;2质粒系统和3质粒系统有可能产生有活性的病毒&＃xff0c;4质粒系统主要是&＃xff1a;pGag/Pol、pRev、pVSV-G&＃xff0c;此外&＃xff0c;还有一个可以放置目的基因序列的载体。这个体系产生活性病毒的可能被大大降低。(5′端LTR被替换成了CMV&＃xff0c;3′端LTR被换成了SV40 ployA 这两个都是可以增强表达&＃xff0c;减低病对人体毒危害性)

我们来看一个4质粒系统的
pMDLg/RRE:这个质粒携带了gag,pol,rre元件

pRSV-Rev &＃xff1a;这个质粒携带了&＃xff0c;rsv,rev元件

vsvg质粒&＃xff1a;携带了vsvg元件&＃xff0c;CMV启动子等

核心质粒&＃xff1a;携带了SV40, RRE&＃xff0c;CMV,目的序列

拥有了这四个质粒以后&＃xff0c;就可以去准备慢病毒的包装实验了&＃xff0c;

pre&＃xff1a;一定要用去内毒素的试剂盒去提质粒&＃xff0c;如果质粒没有去内毒素的话&＃xff0c;会很大的影响转染的效率。可能会导致结果失败&＃xff01;

(什么是内毒素&＃xff1f;它是革兰氏阴性菌的细胞膜上的一种脂&＃xff0c;伴随着细胞的死亡会大量的释放出来&＃xff0c;如果进入到细胞内的话会影响细胞活性)

我用的是lip2000包病毒&＃xff0c;根据lip2000的说明书进行操作。附上说明书https://wenku.baidu.com/view/6fc64b4adaef5ef7bb0d3c0b.html?rec_flag&＃61;default

Ref&＃xff1a;
1&＃xff1a;慢病毒载体及其研究进展https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6000409/
2&＃xff1a;lip2000说明书
https://wenku.baidu.com/view/6fc64b4adaef5ef7bb0d3c0b.html?rec_flag&＃61;default
3&＃xff1a;慢病毒包装实验参考https://wenku.baidu.com/view/deca10fd770bf78a652954f1.html?rec_flag&＃61;default&sxts&＃61;1564996921080