《细胞转染技术进展与方法学评估》

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造血干细胞扩增、转染以及基因编辑优化解决方案

细胞转染的方法主要包括&＃xff1a;人工脂质体法、磷酸钙法、DEAE-右旋糖苷法、电穿孔法、病毒转导法等&＃xff0c;上期详解了细胞转染常用的方法-脂质体转染的原理和步骤 等&＃xff0c;今天做个细胞转染技术大比拼&＃xff0c;了解各种细胞转染的方法优缺点&＃xff0c;再根据自己的实验要求选择理想的方法&＃xff0c;获得漂亮的实验结果。

接下来&＃xff0c;详述一下几种经典细胞转染的方法。

一、人工脂质体法

带正电的脂质体与核酸带负电的磷酸基团形成复合物&＃xff0c;进而可被细胞内吞稳定转染/瞬时性转染。这种方法几乎适用于所有细胞&＃xff0c;转染效率高、重复型好&＃xff0c;但转染时需要去除血清&＃xff0c;转染效果随细胞类型变化大。

脂质体转染的原理与步骤&＃xff1a;

二、磷酸钙法

通常穿了“隐身衣”核酸分子在“照妖镜”磷酸钙的作用下可形成“肉眼可见”的磷酸钙-DNA共沉淀&＃xff0c;可使共沉淀中浓缩DNA分子与细胞表面结合并通过内吞作用进入细胞。该法可用于瞬时或稳定转染。然而因其对pH、温度和缓冲液盐浓度的微小变化十分敏感&＃xff0c;所得结果容易出现差异&＃xff0c;且对许多类型的细胞培养物(尤其是原代细胞)具有细胞毒性&＃xff0c;转染效率较差。

三、DEAE-右旋糖苷法

常言道&＃xff1a;同性相斥&＃xff0c;异性相吸。因而&＃xff0c;当带正电的DEAE-右旋糖苷与核酸中带负电的磷酸骨架相遇&＃xff0c;妥妥的火花四射&＃xff0c;而后会被细胞膜抱团相拥并通过细胞内吞作用迎客到家。该法可用于瞬时转染&＃xff0c;操作相对简单、结果可重复&＃xff0c;但是对细胞有一定的毒副作用&＃xff0c;且转染时需要血清。

四、电穿孔法

有时&＃xff0c;细胞有些“油盐不进”&＃xff0c;就是不开放门户给核酸放行&＃xff0c;此时各位小伙伴可采用一些强硬手段—电穿孔法。此法利用高脉冲电压破坏细胞膜电位&＃xff0c;使得DNA 通过膜上形成的小孔导入稳定/瞬时性转染&＃xff0c;适用于所有类型的细胞&＃xff0c;但细胞致死率高&＃xff0c;DNA和细胞用量大&＃xff0c;且需根据不同细胞类型优化电穿孔实验条件。

其他物理基因输送法还包括基因枪、直接显微注射等方式。前者又称为粒子轰击&＃xff0c;可将包裹着核酸的显微重金属颗粒告诉射入受体细胞内&＃xff0c;适用于瞬时性转染。该技术可需要昂贵的设备&＃xff0c;且细胞死亡率较高。而后者则是通过精细的注射针将核酸送入胞浆中&＃xff0c;一次只能输送一个细胞中&＃xff0c;适用于构建转基因动物或输送人工染色体。

五、病毒转导法

一般&＃xff0c;病毒介导的转染也称之为转导&＃xff0c;它为难以转染的细胞类型提供了一种方法&＃xff0c;可用于蛋白质过表达或抑制&＃xff0c;是临床研究中最常用的方法。它通过侵染宿主细胞将外源基因整合到染色体中&＃xff0c;可用于难转染细胞、原代细胞的稳定性转染。

技术应用案例&＃xff1a;

LONZA 4D-Nucleofector细胞核转染系统&＃xff0c;即原德国Amaxa 4D-Nucleofector核转系统&＃xff0c;结合电穿孔技术和细胞特异性转染液&＃xff0c;通过系统内置优化的转染程序&＃xff0c;将外源基因高效导入目标细胞的细胞质中&＃xff0c;并可直接入核&＃xff0c;整合到细胞染色体中。

Nucleofector核转系统可用于免疫细胞、干细胞、神经细胞、内皮细胞等较难转染的原代细胞和各类细胞系中&＃xff0c;其不依赖于病毒感染、不依赖于细胞有丝分裂&＃xff0c;可加快基因表达&＃xff0c;已成功转染1200余种细胞系、130余种原代细胞&＃xff0c;多数细胞系转染效率可高达50-70%&＃xff0c;部分原代细胞转染效率可超过90%。目前&＃xff0c;LONZA 4D-Nucleofector已大量应用于CAR-T细胞的研究中。

图.用Nucleofector细胞核转染系统&＃xff0c;将GFP标记的质粒转染新生儿皮肤成纤维细胞&＃xff08;NHDF-neo&＃xff09;&＃xff0c;2小时后用3.5% PFA 固定&＃xff0c;共聚焦显微镜可观察到GFP蛋白在细胞核内表达。

LONZA 4D-Nucleofector细胞核转染系统&＃xff0c;配备多种转染模块&＃xff0c;可满足不同细胞类型、不同数量、不同通量的转染实验需求&＃xff1b;

电转过程中配合使用不同细胞类型专用转染试剂&＃xff0c;转染效率远高于传统电转仪&＃xff1b;

采用由新型高分子聚合物制造的电极&＃xff0c;相比传统铝制电转杯&＃xff0c;杜绝金属离子毒害&＃xff0c;细胞转染后成活率更高。

为提高细胞核转染效率&＃xff0c;优化转染条件必不可少&＃xff0c;相比其他品牌&＃xff0c;LONZA可提供全球共享的数据库&＃xff0c;可检索到700种以上的细胞转染数据和操作手册&＃xff0c;除转染操作指导外&＃xff0c;还提供细胞来源、传代、生长条件、培养基、转染后细胞培养基等各类技巧&＃xff0c;大大节省摸索时间和试剂耗材损耗。

4D-Nucleofector细胞核转染平台&＃xff0c;在小体积转染条件优化成功后&＃xff0c;可不改变转染条件&＃xff0c;直接用于大体积转染中&＃xff0c;一次获得最多1*10^9数量的细胞&＃xff0c;大大缩短实验时间。

LONZA 4D-Nucleofector细胞核转染系统&＃xff0c;由1个主机加不同模块构成&＃xff0c;各模块可单独配置&＃xff1a;

1.C模块&＃xff08;必选&＃xff09;&＃xff1a;细胞核转染系统主机&＃xff0c;即核心模块&＃xff08;Core unit&＃xff09;&＃xff0c;内置各类细胞转染程序。

2.X模块&＃xff08;可选&＃xff09;&＃xff1a;最常选择的小体积转染模块&＃xff0c;用于各类悬浮细胞转染。允许使用2个电极杯和1个中通量16孔电极板条。其中电极杯为100uL体系&＃xff0c;适用于2*10^5至2*10^7数量细胞&＃xff1b;16孔电极板条各孔为20uL体系&＃xff0c;适用于2*10^4至1*10^6数量细胞&＃xff0c;可同时转染16个样品。

3.Y模块&＃xff08;可选&＃xff09;&＃xff1a;用于各类贴壁细胞的原位转染&＃xff0c;无需消化细胞。允许使用1个24孔电极板&＃xff0c;各孔为350uL体系&＃xff0c;可同时转染24个样品。

4.LV模块&＃xff08;可选&＃xff09;&＃xff1a;用于一种细胞的大规模连续转染。允许使用电转盘&＃xff0c;其中小体积电转盘允许手动注射填充1mL&＃xff0c;适用于1*10^7至1*10^8数量细胞&＃xff1b;更大体积的电转盘允许以1mL体积不断进样&＃xff0c;配合储液罐或储液袋&＃xff0c;连续处理20mL体积&＃xff0c;最高可转染10^9数量细胞。

5.96孔模块&＃xff08;可选&＃xff09;&＃xff1a;用于高通量细胞转染&＃xff0c;需要同时配置X模块。允许使用1个可拆卸的96孔电极板&＃xff0c;由6个16孔电极板条组成&＃xff0c;适用于2*10^4至1*10^6数量细胞&＃xff0c;可同时转染96个样品&＃xff0c;经常用于摸索转染条件。

相关文献

Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells.(Curr Protoc Immunol,2019,124(1):e69)

Engineering of CRISPR-Cas12b for human genome editing.(Nature,2019,10(1):212)

CRISPR-Cas9 genome engineering of primary CD4&＃43; T cells for the interrogation of HIV-host factor interactions.(Nat Protocols,2019,14(1):1-27)

Bacteria-free minicircle DNA system to generate integration-free CAR-T cells.(J Med Genetics,2019,56:10-17)

Guide Swap enables genome-scale pooled CRISPR-Cas9 screening in human primary cells.(Nat Methods,2018,15(11))

Nucleofection with Plasmid DNA for CRISPR/Cas9-Mediated Inactivation of Programmed Cell Death Protein 1 in CD133-Specific CAR T Cells.(Hum Gene Ther,2018)

Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells.(J Exp Med,2018,215(3):985-997)

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