3蛋白wb_只会半定量分析？来看WB的灵活运用吧

WB实验是我们平时最常接触到的实验类型&＃xff0c;也是最经典的免疫学实验&＃xff0c;每年写WB实验技巧的文章&＃xff0c;真是让人看花了眼&＃xff0c;如果你厌倦了老生常谈的实验技巧&＃xff0c;不如来看看我们今天的拓展&＃xff0c;WB在半定量分析之外的妙用吧。

一、目标蛋白构象结合功能分析

WB 用于构象分析&＃xff0c;主要基于其不同构象形式时分子量所发生的变化&＃xff0c;比如不同的寡聚、翻译后修饰、配体结合等情况。还原和非还原型电泳分析链间二硫键&＃xff0c;并判断蛋白聚合情况&＃xff1b;

抗体表位分析法初步判断蛋白空间结构&＃xff1b;利用&＃xff08;N - 端或 C - 端&＃xff09;抗体研究蛋白异构体及翻译后酶切修饰&＃xff1b;更重要的是&＃xff0c;WB 等方法获得的是蛋白在寡聚、结合配体、底物、信号标签等生理条件下&＃xff0c;其分子量的动态变化&＃xff0c;从而将蛋白结构研究与功能研究有机结合。

泛素化-蛋白酶体系统对于错误蛋白降解具有重要意义。上图显示 Nrf2 蛋白在泛素连接酶作用时间延长后&＃xff0c;泛素化程度逐渐增加。若将各时间点的 Nrf2 蛋白结构解析&＃xff0c;即可将该蛋白的结构研究与功能研究相结合。在 Virology 的这篇文献中&＃xff0c;作者发现蛋白酶体抑制剂 MG132 和 lactacystin 可显著降低猪 II 型圆环病毒&＃xff08;PCV2&＃xff09;早期感染的滴度&＃xff0c;并通过对泛素基因的沉默实验&＃xff0c;发现其也显著降低 PCV2 滴度&＃xff0c;由此推断泛素 - 蛋白酶体系统是 PCV2 的早期复制所必须的。

二、磷酸化信号分析

磷酸化是细胞信号系统的重要调节方式&＃xff0c;特异的磷酸化抗体可以用于&＃xff1a;分析信号分子磷酸化水平&＃xff0c;从而与其功能研究建立联系&＃xff1b;分析不同磷酸化位点对于信号分子功能的影响&＃xff0c;比如 p53 总磷酸化水平与不同位点磷酸化水平对转录的调控&＃xff0c;以及与癌症发生发展之间的联系。

Cai 等在JBC上发表的文章&＃xff0c;揭示了微小RNA在肿瘤发生中的调节作用。研究发现微小RNA miR-17/20a 靶向抑制 p53 的核心激酶DAPK3&＃xff08;死亡相关蛋白激酶 3&＃xff09;的表达&＃xff0c;去除这些微小 RNA 将导致依赖于 p53 的微小RNA转录抑制被去除&＃xff0c;从而形成一个正反馈环&＃xff0c;促进肿瘤形成&＃xff0c;它们被称为原癌微小 RNA&＃xff08;oncomiRs&＃xff09;。C图清楚显示了当对 Hela 细胞转入 miR-17、miR-20a 或 miR-17/20a 拮抗剂后&＃xff0c;DAPK3 蛋白表达增加&＃xff0c;双链 DNA 不稳定性的标志物 ATM&＃xff08;Ser-1981&＃xff09;、p53BP1&＃xff08;Ser-25/29&＃xff09;蛋白丝氨酸磷酸化程度增高&＃xff0c;而各自总蛋白水平并没有变化。D 图进一步确认了这些磷酸化水平升高是由 DAPK3 表达量升高引起的。p53 磷酸化水平升高将导致其抑制原癌微小 RNA 转录的水平下降&＃xff0c;进一步提高 DAPK3 激酶的表达。该研究补充了原有的通过 E2F 家族蛋白激活 miR-17/20a 的负反馈调节通路。

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